Anticorpi Secondari

Enzimi, come la perossidasi di rafano (HRP) o la fosfatasi alcalina (AP), possono coniugarsi con un anticorpo tramite legami covalenti. Gli anticorpi coniugati con enzimi vengono utilizzati in combinazione con un substrato, che può essere fluorogenico, colorimetrico o chemiluminescente, per creare un segnale rilevabile. Il substrato solubile non rilevabile viene convertito dall'enzima in una forma rilevabile (e normalmente insolubile). Gli anticorpi coniugati con enzimi consentono l'amplificazione del segnale; poiché l'enzima è in grado di convertire molte molecole del substrato, il periodo di tempo in cui la reazione può continuare determina l'intensità del segnale.

Perossidasi di Rafano

La perossidasi di rafano (HRP) è un enzima derivato dalla radice di Armoracia rusticana (alias la pianta di rafano) comunemente usata come proteina reporter. Gli anticorpi secondari coniugati con HRP possono essere utilizzati per il rilevamento colorimetrico, in cui l'HRP catalizza la conversione di un substrato cromogenico in un precipitato colorato, o per il rilevamento chemiluminescente, in cui l'HRP produce un segnale ossidando un substrato chemiluminescente in una forma che emette luce.

Molteplici molecole di HRP possono legarsi a un singolo anticorpo secondario, pertanto gli anticorpi secondari coniugati con HRP possono essere utilizzati per migliorare il segnale e consentire il rilevamento di proteine espresse a bassi livelli. HRP ha anche un alto tasso di turnover che consente agli anticorpi secondari coniugati con HRP di generare un segnale forte in un breve lasso di tempo (spesso entro cinque minuti).

Alkaline Phosphatase

Gli anticorpi secondari coniugati con fosfatasi alcalina (AP) sono comunemente usati per ELISA e western blotting. A volte sono anche usati per l'immunoistochimica, tuttavia, le loro grandi dimensioni possono limitare la penetrazione nei tessuti. Vale la pena notare che mentre HRP genera rapidamente un segnale massimo, spesso entro cinque minuti, il segnale da AP aumenta gradualmente e raggiunge il picco intorno a un'ora. AP genera un segnale molto stabile che può durare diversi giorni; questo è particolarmente utile se sono necessarie esposizioni multiple, soprattutto nell'arco di pochi giorni.

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Usa la nostra tabella qui sotto per aiutare con la decisione.

Biotina

La biotina è una piccola vitamina B idrosolubile che può essere legata con alta affinità ad avidina, NeutrAvidin e streptavidina. A causa delle sue piccole dimensioni, il legame con la biotina in genere non influisce sull'attività biologica di una proteina. Molteplici molecole di biotina possono coniugarsi a un singolo anticorpo secondario, pertanto gli anticorpi secondari coniugati con biotina possono essere utilizzati per il potenziamento del segnale e consentire il rilevamento di proteine espresse a bassi livelli. La visualizzazione avviene attraverso l'interazione biotina/streptavidina per cui la streptavidina è legata all'HRP oa una sonda fluorescente. Utilizzando un anticorpo secondario coniugato con biotina, lo stesso anticorpo secondario può essere utilizzato in più applicazioni semplicemente cambiando la streptavidina utilizzata.

Gli anticorpi secondari coniugati con colorante fluorescente consentono un segnale più luminoso e forniscono la capacità di distinguere tra più proteine in un singolo campione, in quanto tali, sono uno strumento prezioso per identificare le proteine in immunocitochimica, western blotting, immunofluorescenza, immunoistochimica e molte altre applicazioni . I comuni coloranti fluorescenti includono la gamma Alexa Fluor, AMCA, Cy3, FITC, PE e TRITC.

Esempi di rilevamento fluorescente:

Figure 1: Anti-GFAP Anticorpo (A85307) (verde) marca fortemente le cellule astrogliali, mostrato da IF in una sezione dell'ippocampo di topo.

Figure 2: Anti-FOX3 Antibody (A85403) (rosso) colora fortemente i nuclei dei neuroni nello strato di granuli cerebellari, mostrato da IF in una sezione del cervelletto di topo.

Un anticorpo è una glicoproteina "a forma di Y" in grado di legarsi ad antigeni specifici. Ciascun anticorpo è composto da quattro catene polipeptidiche, due catene pesanti identiche e due catene leggere identiche, che variano in sequenza e lunghezza tra le specie e tra le classi di isotipi. La struttura di un anticorpo può essere suddivisa in: due regioni F(ab), le sezioni superiori della "Y" che contengono la regione variabile che si lega specificamente a un particolare epitopo sull'antigene; una regione cerniera; e una regione Fc, la parte inferiore della "Y" che fornisce un sito di legame per i recettori Fc endogeni (e gli anticorpi secondari).

Nei mammiferi, gli anticorpi sono classificati in cinque classi principali o isotipi in base alla catena pesante che contengono. Questi sono: IgA (alfa), IgD (delta), IgE (epsilon), IgG (gamma) e IgM (mu). Ogni classe differisce nella sequenza dei domini costanti, nel numero di domini costanti, nella struttura a cerniera e nella valenza dell'anticorpo. Le catene leggere di un anticorpo sono classificate come kappa o lambda in base alla loro sequenza polipeptidica. Tipicamente, le due catene leggere in un singolo anticorpo sono dello stesso tipo.

Gli anticorpi interi possono essere digeriti dalla papaina o dalla pepsina per formare anticorpi frammento F(ab), F(ab') e F(ab')₂, che non hanno porzione Fc o una porzione Fc significativamente ridotta. Le strutture dei frammenti F(ab), F(ab') e F(ab')₂ differiscono: i frammenti F(ab) sono singole porzioni F(ab) che legano l'antigene, i frammenti F(ab') sono singole F(ab) porzioni con la regione di cerniera presente, e i frammenti F(ab')₂ sono due porzioni F(ab) collegate tramite la regione di cerniera. Gli anticorpi secondari del frammento F(ab), F(ab') e F(ab')₂ vengono utilizzati per prevenire il legame non specifico tra la regione Fc di un anticorpo e il recettore Fc su una cellula.

Classi e Sottoclassi di Anticorpi

La specie dell'anticorpo secondario dipende dalla specie ospite dell'anticorpo primario che si sta utilizzando. Gli anticorpi secondari sono sviluppati contro una classe o sottoclasse di immunoglobuline di una specie specifica. È necessario selezionare un anticorpo secondario che è stato allevato in una specie diversa contro la specie ospite e l'isotipo dell'anticorpo primario. Ad esempio, se hai utilizzato un anticorpo primario policlonale allevato in capra, avrai bisogno di un anticorpo secondario Anti-Goat IgG (Catene pesanti e leggere) creato in una specie diversa.

Gli anticorpi secondari purificati per affinità subiscono un processo per rimuovere gli anticorpi secondari non specifici della classe; di conseguenza, questi anticorpi secondari producono meno segnale di fondo e sono una scelta popolare tra i ricercatori. Ad esempio, un anticorpo secondario di coniglio anti-IgG2a di topo verrebbe purificato per affinità utilizzando IgG2a di topo immobilizzato per purificare tutti gli anticorpi di coniglio che si legano all'IgG2a di topo. Questi anticorpi anti-IgG2a possono quindi essere ulteriormente purificati mediante passaggio attraverso una o più colonne cromatografiche contenenti IgE, IgG1, IgG2b, IgG3 e IgG4 di topo (ecc.); questo rimuove eventuali anticorpi che hanno reattività crociata con isotipi diversi da IgG2a.

Gli anticorpi del frammento F(ab), F(ab') e F(ab')₂ vengono utilizzati per eliminare il legame non specifico tra la regione Fc di un anticorpo e il recettore Fc su una cellula. Questi frammenti di anticorpi si legano ancora agli antigeni, ma non hanno porzione Fc o hanno una porzione Fc significativamente ridotta (a causa della digestione da parte della papaina o della pepsina). La struttura dei frammenti F(ab), F(ab') e F(ab')₂ differisce: i frammenti F(ab) sono singole porzioni F(ab) che legano l'antigene, i frammenti F(ab') sono singole F(ab) porzioni con la regione di cerniera presente, e i frammenti F(ab')₂ sono due porzioni F(ab) collegate tramite la regione di cerniera. È una buona idea utilizzare un anticorpo con frammento F(ab), F(ab') o F(ab')₂ quando si lavora con campioni che esprimono alti livelli di recettori Fc.

Il pre-assorbimento viene utilizzato per aumentare la specificità di un anticorpo secondario al fine di ridurre al minimo qualsiasi legame non specifico. Se stai pianificando la colorazione con più anticorpi primari e diversi anticorpi secondari contemporaneamente, dovresti considerare l'uso di anticorpi secondari preassorbiti. Il pre-assorbimento riduce la cross-reattività tra l'anticorpo secondario e le eventuali immunoglobuline endogene presenti nel campione.

Al fine di creare anticorpi secondari pre-adsorbiti, gli anticorpi secondari vengono fatti passare attraverso una matrice contenente proteine del siero immobilizzate da una gamma di specie; qualsiasi anticorpo che reagisce crociata viene catturato dalla matrice e rimosso dal campione. Di conseguenza, gli anticorpi secondari preassorbiti contengono solo anticorpi che riconoscono specificamente l'anticorpo primario desiderato.

Un anticorpo primario si lega direttamente ad antigeni specifici, con elevata specificità e affinità, allo scopo di purificare o rilevare e misurare gli antigeni. Gli anticorpi primari possono essere sviluppati come anticorpi monoclonali, che si legano a uno specifico epitopo sull'antigene, oppure possono essere anticorpi policlonali, che si legano a più epitopi diversi sull'antigene. Gli anticorpi primari possono essere forniti non coniugati o direttamente coniugati con un enzima (come HRP o AP) o un fluoroforo (come Cy3 o FITC) per consentire la visualizzazione. Gli anticorpi secondari sono sviluppati per legare isotipi specifici di anticorpi primari. Se un anticorpo primario non è coniugato, non può essere visualizzato senza l'aggiunta di un anticorpo secondario coniugato che si lega all'anticorpo primario. L'anticorpo secondario sarà coniugato con un enzima o un fluoroforo per consentire la visualizzazione.

Un controllo solo secondario è dove i campioni vengono incubati con PBS o diluente anticorpale, invece dell'anticorpo primario. È importante che il resto del protocollo sia identico agli altri campioni. Questo controllo aiuta a determinare la specificità della colorazione/segnale osservata. L'assenza di colorazione nel controllo solo secondario implica che la colorazione osservata negli altri campioni sia specifica e generata dall'anticorpo secondario che lega solo l'anticorpo primario. Una colorazione considerevole nel controllo solo secondario implica che la colorazione (per tutti i campioni) è aspecifica e origina dall'anticorpo secondario che si lega alle immunoglobuline endogene presenti nel tessuto o ad altri antigeni non bersaglio.

Gli anticorpi secondari facilitano l'amplificazione del segnale che può migliorare la sensibilità di un'analisi e consentire il rilevamento di proteine espresse a bassi livelli. L'amplificazione del segnale può essere il risultato diretto di più anticorpi secondari che si legano a un singolo anticorpo primario o il risultato dell'uso di un anticorpo secondario coniugato con enzima (cioè più a lungo si lascia continuare una reazione, maggiore è il segnale).

Ad alta concentrazione, alcuni anticorpi possono formare aggregati che possono provocare un segnale maculato nei test di immunocolorazione. La centrifugazione della fiala di anticorpo ad alta velocità per 10-15 minuti e il pipettaggio accurato della soluzione anticorpale (è importante fare attenzione a non toccare il fondo della fiala) possono aiutare a rimuovere eventuali aggregati che potrebbero essersi formati. Vale anche la pena ricontrollare che i vetrini e i coprioggetto siano puliti, in quanto ciò può anche dare l'impressione di screziature. Se sembrano sporchi al microscopio, puliscili con alcol al 100%.

Quando esegui un esperimento multi-etichetta, dovresti mirare a utilizzare solo anticorpi secondari allevati nella stessa specie. Ciò garantisce che gli anticorpi secondari riconoscano solo l'anticorpo primario previsto e non altri anticorpi secondari.

Il tipo di etichetta che scegli dipenderà dalla tecnica che stai eseguendo. Ad esempio, gli anticorpi secondari coniugati con enzimi (come HRP o AP) sono comunemente usati per ELISA e immunoblotting. L'HRP è un enzima sia economico che stabile, tuttavia, l'AP può essere più sensibile in determinate situazioni (ad esempio per l'analisi colorimetrica).

Per la citometria a flusso, l'immunoistochimica e l'immunofluorescenza le etichette ideali possono essere enzimi o fluorocromi. La colorazione DAB è efficace come etichetta singola o come secondo colore per l'etichettatura di più antigeni in IHC. In alternativa, un sistema biotina/avidina in due fasi può essere utilizzato per il potenziamento del segnale e per consentire il rilevamento di proteine espresse a bassi livelli.

La struttura dell'anticorpo primario e dell'anticorpo secondario può essere o meno la stessa a seconda dell'ospite, della clonalità e dell'isotipo degli anticorpi selezionati.

Un anticorpo è una glicoproteina "a forma di Y" in grado di legarsi ad antigeni specifici. Ciascun anticorpo è composto da quattro catene polipeptidiche, due catene pesanti identiche e due catene leggere identiche, che variano in sequenza e lunghezza tra le specie e tra le classi di isotipi. La struttura di un anticorpo può essere suddivisa in: due regioni F(ab), le sezioni superiori della "Y" che contengono la regione variabile che si lega specificamente a un particolare epitopo sull'antigene; una regione cerniera; e una regione Fc, la parte inferiore della "Y" che fornisce un sito di legame per i recettori Fc endogeni (e gli anticorpi secondari).

Nei mammiferi, gli anticorpi sono classificati in cinque classi principali o isotipi in base alla catena pesante che contengono. Questi sono: IgA (alfa), IgD (delta), IgE (epsilon), IgG (gamma) e IgM (mu). Ogni classe differisce nella sequenza dei domini costanti, nel numero di domini costanti, nella struttura a cerniera e nella valenza dell'anticorpo.

Le catene leggere di un anticorpo sono classificate come kappa o lambda in base alla loro sequenza polipeptidica. Tipicamente, le due catene leggere in un singolo anticorpo sono dello stesso tipo. Pertanto, le differenze strutturali tra anticorpi primari e secondari dipendono dalla specie, dall'isotipo, dalla clonalità e dalla specificità bersaglio dei due anticorpi.