Anticorpi Primari

Un anticorpo è una glicoproteina a forma di Y, prodotta dal sistema immunitario dell'organismo in risposta all'invasione di molecole estranee, in grado di legarsi ad antigeni specifici. Ciascun anticorpo è composto da quattro catene polipeptidiche, due catene pesanti identiche e due catene leggere identiche, che variano in sequenza e lunghezza. Un anticorpo può essere suddiviso in due regioni F(ab), le sezioni superiori della 'Y' che contengono la regione variabile che si lega specificamente a un particolare epitopo sull'antigene, e una regione Fc, la parte inferiore della 'Y' che fornisce un sito di legame per i recettori Fc endogeni (e gli anticorpi secondari).

Figura 1: Rappresentazione grafica di un anticorpo.

Gli anticorpi monoclonali vengono prodotti iniettando un antigene in un animale ospite per avviare una risposta immunitaria umorale e successivamente estraendo le cellule della milza che producono anticorpi e fondendole in vitro con cellule di mieloma maligno coltivate per creare linee cellulari immortali di ibridoma. Ciò fornisce una fornitura stabile ea lungo termine di anticorpi monoclonali. Gli anticorpi monoclonali sono identici, riconoscono un singolo epitopo e derivano da un gruppo di cellule clonate identiche. A ciascun clone di cellule di ibridoma viene assegnato un ID clone che identifica l'anticorpo monoclonale che produce.

Gli anticorpi policlonali vengono prodotti iniettando un antigene in un animale ospite per avviare una risposta immunitaria umorale. Dopo l'immunizzazione iniziale, l'animale ospite riceverà un'immunizzazione secondaria, e potenzialmente terziaria, al fine di produrre concentrazioni più elevate di anticorpi contro il particolare antigene. Gli anticorpi policlonali sono una raccolta di più anticorpi diversi, derivati dalla risposta immunitaria di più cellule B, che riconoscono ciascuno un epitopo diverso sullo stesso antigene.

Anticorpi Monoclonale contro Policlonale

Nei mammiferi, gli anticorpi sono classificati in cinque classi principali o isotipi in base alla catena pesante che contengono. Questi sono: IgA (alfa), IgD (delta), IgE (epsilon), IgG (gamma) e IgM (mu). Ogni classe differisce in: la sequenza dei domini costanti, il numero di domini costanti, la struttura a cerniera e la valenza dell'anticorpo.

Le catene leggere di un anticorpo sono classificate come kappa o lambda in base alla loro sequenza polipeptidica. Tipicamente, in un singolo anticorpo è presente un solo tipo di catena leggera e, come tale, le due catene leggere sono identiche.

L'IgG (costituito da IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 e IgG4) è l'anticorpo più abbondante nel siero umano normale, rappresentando il 70-85% del pool totale di immunoglobuline. Le IgG sono coinvolte nel trasferimento placentare, con le IgG della madre che si trasferiscono al feto per fornire protezione immunitaria durante le fasi iniziali dello sviluppo.

Figura 2: Rappresentazione grafica delle IgG.

Ogni ovale rappresenta un dominio proteico nell'anticorpo. Questi sono sistematicamente etichettati in base al loro tipo di catena (L = catena leggera o H = catena pesante) e se la loro sequenza cambia per legare un antigene (V = dominio variabile o C = dominio costante), con domini CH numerati dalla regione variabile. I domini sono uniti da regioni linker di legami proteici e disolfuro, rappresentati da linee.

La struttura dell'anticorpo è anche descritta in termini di frammenti prodotti dalla degradazione proteica o scissione enzimatica delle regioni linker, vale a dire i frammenti leganti l'antigene (Fab), i frammenti variabili (Fv) e il frammento costante (Fc).

L'IgA (costituito da IgA1 e IgA2) rappresenta circa il 5-15% del pool di anticorpi; esistente sia come monomero che come dimero. L'IgA è l'anticorpo predominante nelle secrezioni mucose, come: saliva, lacrime e latte.

Figura 3: Rappresentazione grafica delle IgA.

L'IgD rappresenta solo circa l'1% dell'immunoglobulina plasmatica totale, tuttavia si trova in grandi quantità sulla membrana delle cellule B. L'IgD ha la stessa struttura di base dell'IgG ma ha una regione cerniera estesa, che è suscettibile alla digestione proteolitica. Si pensa che l'IgD serva come recettore dell'antigene per l'attivazione delle cellule B.

Figura 4: Rappresentazione grafica delle IgD.

Le IgE rappresentano solo circa lo 0,002% degli anticorpi sierici e si trovano sui basofili e sui mastociti. Simile a IgM, IgE ha due domini costanti aggiuntivi invece di una regione cerniera. Si pensa che le IgE svolgano un ruolo nell'immunità ai parassiti, ma sono più comunemente associate all'ipersensibilità immediata di tipo I, rispondendo ad antigeni ambientali innocui come polline e arachidi, che possono provocare reazioni estreme come anafilassi o rinocongiuntivite allergica.

Figura 5: Rappresentazione grafica delle IgE.

L'IgM rappresenta tra il 5-10% della popolazione di immunoglobuline ed è l'anticorpo predominante nella risposta immunitaria primaria dell'organismo. È spesso rappresentato come un pentamero, con una struttura a cinque catene tenuta insieme da una catena J, tuttavia può esistere anche in forma esamerica, senza la catena J, e come monomero sulla superficie delle cellule B. Le grandi dimensioni delle IgM solubili (~ 900 kDa) confinano principalmente questo anticorpo nel pool intravascolare.

Figura 6: Rappresentazione grafica delle IgM.

Ciascun numero di clone rappresenta una linea cellulare specifica clonata dall'ascite che è stata utilizzata per produrre l'anticorpo. Poiché gli anticorpi sono prodotti da più di un ospite, ogni linea cellulare clonata riceve un numero di clone univoco per identificarla.

Gli anticorpi secondari dovrebbero essere raccolti contro la specie ospite dell'anticorpo primario che stai usando. Ad esempio, se il tuo anticorpo primario è un monoclonale di ratto, avrai bisogno di un anticorpo secondario anti-ratto. Si consiglia di controllare la scheda tecnica dell'anticorpo secondario per assicurarsi che sia stato convalidato nell'applicazione che si utilizzerà.

I controlli isotipici vengono utilizzati per confermare che il legame dell'anticorpo primario è specifico e non è il risultato di altre interazioni proteiche o del legame non specifico del recettore Fc.

L'anticorpo di controllo dell'isotipo deve corrispondere alle specie ospiti degli anticorpi primari, all'isotipo e alla coniugazione. Ad esempio, se l'anticorpo primario è un IgG1 di ratto coniugato con HRP, allora sarà necessario un controllo dell'isotipo IgG1 di ratto coniugato con HRP.

Si consiglia di controllare prima la scheda tecnica, che spesso avrà un controllo positivo suggerito. È importante assicurarsi che il tessuto o la linea cellulare utilizzata provenga da una specie testata.

Se non vengono suggeriti controlli positivi, si consiglia di consultare il sito Web di UniProt. Questo database contiene spesso un elenco di tessuti in cui è espressa la proteina. Questi tessuti possono essere considerati controlli positivi idonei.

Molti dei nostri anticorpi hanno istruzioni di diluizione sui loro fogli dati. In questi casi, ti consigliamo di seguire queste istruzioni. Per gli anticorpi che non hanno diluizioni consigliate, si consiglia di utilizzare la tabella sottostante per decidere una diluizione iniziale.

La maggior parte degli anticorpi non purificati (cioè l'intero antisiero, il surnatante di coltura o il liquido di ascite) non avrà una concentrazione indicata sui fogli dati, poiché non sarà stata determinata. Questi anticorpi possono variare in modo significativo nelle concentrazioni di anticorpi specifici. Come stime approssimative di concentrazione: i surnatanti della coltura tissutale sono 1-3 mg/ml, l'ascite è 5-10 mg/ml e gli antisieri interi sono 1-10 mg/ml.

È importante ricordare che le diluizioni/concentrazioni nella tabella sopra sono consigliate semplicemente come punto di partenza. Potrebbe essere necessario regolare la diluizione/concentrazione in base ai risultati sperimentali.

Si consiglia di conservare sempre l'anticorpo come indicato sulla scheda tecnica. Non siamo in grado di garantire le prestazioni dell'anticorpo se conservato in condizioni diverse.

La dimensione delle aliquote dipenderà da quanto si usa tipicamente in un esperimento. Le aliquote non devono essere inferiori a 10µl. Più piccola è l'aliquota, più la concentrazione è influenzata dall'evaporazione e dall'adsorbimento dell'anticorpo sulla superficie della fiala.