Anticorps Primaires

Un anticorps est une glycoprotéine en forme de Y, produite par le système immunitaire du corps en réponse à l'invasion de molécules étrangères, qui est capable de se lier à des antigènes spécifiques. Chaque anticorps est composé de quatre chaînes polypeptidiques, deux chaînes lourdes identiques et deux chaînes légères identiques, dont la séquence et la longueur varient. Un anticorps peut être décomposé en deux régions F(ab), les sections supérieures du « Y » qui contiennent la région variable qui se lie spécifiquement à un épitope particulier sur l'antigène, et une région Fc, le bas du « Y » qui fournit un site de liaison pour les récepteurs Fc endogènes (et les anticorps secondaires).

Figure 1 : Représentation graphique d'un anticorps.

Les anticorps monoclonaux sont produits en injectant un antigène dans un animal hôte afin de déclencher une réponse immunitaire humorale, puis en extrayant les cellules spléniques productrices d'anticorps et en les fusionnant in vitro avec des cellules de myélome malin cultivées pour créer des lignées cellulaires d'hybridomes immortelles. Cela fournit un approvisionnement stable et à long terme en anticorps monoclonaux. Les anticorps monoclonaux sont identiques, reconnaissant un seul épitope, et sont dérivés d'un groupe de cellules clonées identiques. Une ID de clone est donnée à chaque clone de cellules d'hybridome qui identifie l'anticorps monoclonal qu'il produit.

Les anticorps polyclonaux sont produits en injectant un antigène dans un animal hôte afin d'initier une réponse immunitaire humorale. Après l'immunisation initiale, l'animal hôte recevra une immunisation secondaire, et potentiellement tertiaire, afin de produire des concentrations plus élevées d'anticorps contre l'antigène particulier. Les anticorps polyclonaux sont une collection de plusieurs anticorps différents, dérivés de la réponse immunitaire de plusieurs cellules B, qui reconnaissent chacune un épitope différent sur le même antigène.

Anticorps monoclonaux contre polyclonaux

Chez les mammifères, les anticorps sont classés en cinq classes principales ou isotypes selon la chaîne lourde qu'ils contiennent. Ce sont : IgA (alpha), IgD (delta), IgE (epsilon), IgG (gamma) et IgM (mu). Chaque classe diffère par : la séquence de domaines constants, le nombre de domaines constants, la structure charnière et la valence de l'anticorps.

Les chaînes légères d'un anticorps sont classées comme kappa ou lambda en fonction de leur séquence polypeptidique. Typiquement, un seul type de chaîne légère est présent dans un anticorps individuel et, en tant que tel, les deux chaînes légères sont identiques.

L'IgG (constitué d'IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 et IgG4) est l'anticorps le plus abondant dans le sérum humain normal, représentant 70 à 85 % du pool total d'immunoglobulines. Les IgG sont impliquées dans le transfert placentaire, les IgG de la mère étant transférées au fœtus afin de fournir une protection immunitaire pendant les premiers stades du développement.

Figure 2: Représentation graphique des IgG.

Chaque ovale représente un domaine protéique dans l'anticorps. Ceux-ci sont systématiquement marqués par leur type de chaîne (L = chaîne légère ou H = chaîne lourde) et si leur séquence change pour se lier à un antigène (V = domaine variable ou C = domaine constant), avec des domaines CH numérotés à partir de la région variable. Les domaines sont reliés par des régions de liaison des liaisons protéiques et disulfure, représentées par des lignes.

La structure de l'anticorps est également décrite en termes de fragments fabriqués par dégradation protéique ou clivage enzymatique de régions de liaison, à savoir les fragments de liaison à l'antigène (Fab), les fragments variables (Fv) et le fragment constant (Fc).

L'IgA (constituée d'IgA1 et d'IgA2) représente environ 5 à 15 % du pool d'anticorps, existant soit sous forme de monomère, soit sous forme de dimère. L'IgA est l'anticorps prédominant dans les sécrétions muqueuses, telles que la salive, les larmes et le lait.

Figure 3: Représentation graphique des IgA.

L'IgD ne représente qu'environ 1 % de l'immunoglobuline plasmatique totale, cependant, on la trouve en grande quantité sur la membrane des cellules B. L'IgD a la même structure de base que l'IgG mais a une région charnière étendue, qui est sensible à la digestion protéolytique. On pense que l'IgD sert de récepteur d'antigène pour l'activation des cellules B.

Figure 4: Représentation graphique des IgD.

Les IgE ne représentent qu'environ 0,002 % des anticorps sériques et se trouvent sur les basophiles et les mastocytes. Semblable à l'IgM, l'IgE possède deux domaines constants supplémentaires au lieu d'une région charnière. On pense que les IgE jouent un rôle dans l'immunité contre les parasites, mais sont plus souvent associées à une hypersensibilité immédiate de type I, répondant à des antigènes environnementaux inoffensifs tels que le pollen et les arachides, qui peuvent entraîner des réactions extrêmes telles que l'anaphylaxie ou la rhinoconjonctivite allergique.

Figure 5: Représentation graphique des IgE.

L'IgM représente entre 5 et 10 % de la population d'immunoglobulines et est l'anticorps prédominant dans la réponse immunitaire primaire de l'organisme. Il est souvent représenté comme un pentamère, avec une structure à cinq chaînes maintenues ensemble par une chaîne J, cependant, il peut également exister sous une forme hexamérique, sans la chaîne J, et en tant que monomère à la surface des cellules B. La grande taille des IgM solubles (~ 900 kDa) confine principalement cet anticorps au pool intravasculaire.

Figure 6: Représentation graphique des IgM.

Chaque numéro de clone représente une lignée cellulaire spécifique clonée à partir d'ascite qui a été utilisée pour fabriquer l'anticorps. Étant donné que les anticorps monoclonaux sont produits par plus d'un hôte et plus d'une lignée cellulaire, chaque lignée cellulaire clonée reçoit un numéro de clone unique pour l'identifier.

Les anticorps secondaires doivent être dirigés contre l'espèce hôte de l'anticorps primaire que vous utilisez. Par exemple, si votre anticorps primaire est un monoclonal de rat, vous aurez besoin d'un anticorps secondaire anti-rat. Nous vous recommandons de vérifier la fiche technique de l'anticorps secondaire pour vous assurer qu'il a été validé dans l'application que vous utiliserez.

Les contrôles isotypiques sont utilisés pour confirmer que la liaison de l'anticorps primaire est spécifique et ne résulte pas d'autres interactions protéiques ou d'une liaison non spécifique au récepteur Fc.

L'anticorps de contrôle d'isotype doit correspondre à l'espèce hôte, à l'isotype et à la conjugaison des anticorps primaires. Par exemple, si l'anticorps primaire est une IgG1 de rat conjuguée à la HRP, vous aurez besoin d'un contrôle d'isotype IgG1 de rat conjugué à la HRP.

Nous vous recommandons de vérifier d'abord la fiche technique, qui proposera souvent un contrôle positif. Il est important de s'assurer que le tissu ou la lignée cellulaire utilisé provient d'une espèce testée.

Si aucun contrôle positif n'est suggéré, nous vous recommandons de consulter le site Web d'UniProt. Cette base de données contient souvent une liste de tissus dans lesquels la protéine est exprimée. Ces tissus peuvent être considérés comme des témoins positifs appropriés.

Beaucoup de nos anticorps ont des instructions de dilution sur leurs fiches techniques. Dans ces cas, nous vous recommandons de suivre ces instructions. Pour les anticorps qui n'ont pas de dilutions recommandées, nous vous recommandons d'utiliser le tableau ci-dessous pour décider d'une dilution de départ.

La plupart des anticorps non purifiés (c'est-à-dire l'antisérum entier, le surnageant de culture ou le liquide d'ascite) n'auront pas de concentration indiquée sur leurs fiches techniques, car elle n'aura pas été déterminée. Ces anticorps peuvent varier de manière significative dans les concentrations d'anticorps spécifiques. En tant qu'estimations approximatives de la concentration : les surnageants de culture tissulaire sont à 1 à 3 mg/ml, les ascites à 5 à 10 mg/ml et les antisérums entiers à 1 à 10 mg/ml.

Il est important de se rappeler que les dilutions/concentrations dans le tableau ci-dessus sont recommandées simplement comme point de départ. Il peut être nécessaire d'ajuster la dilution/concentration en fonction des résultats expérimentaux.

Nous vous recommandons de toujours stocker l'anticorps comme indiqué sur la fiche technique. Nous ne sommes pas en mesure de garantir les performances de l'anticorps s'il est stocké dans des conditions différentes.

La taille des aliquotes dépendra de la quantité que l'on utilise généralement dans une expérience. Les aliquotes ne doivent pas être inférieures à 10 µl. Plus l'aliquot est petit, plus la concentration est affectée par l'évaporation et l'adsorption de l'anticorps sur la surface du flacon.