Sekundär­antikörper

Enzyme wie Meerrettichperoxidase (HRP) oder alkalische Phosphatase (AP) können über kovalente Bindungen an einen Antikörper konjugieren. Enzymkonjugierte Antikörper werden in Verbindung mit einem Substrat verwendet, entweder fluorogen, kolorimetrisch oder chemilumineszierend, um ein nachweisbares Signal zu erzeugen. Das nicht nachweisbare, lösliche Substrat wird vom Enzym in eine nachweisbare (und normalerweise unlösliche) Form umgewandelt. Enzymkonjugierte Antikörper ermöglichen die Signalverstärkung; Da das Enzym in der Lage ist, viele Moleküle des Substrats umzuwandeln, bestimmt die Dauer, in der die Reaktion fortgesetzt werden kann, die Stärke des Signals.

Meerrettich-Peroxidase

Meerrettichperoxidase (HRP) ist ein Enzym, das aus der Wurzel von Armoracia rusticana (a.k.a. der Meerrettichpflanze) stammt und üblicherweise als Reporterprotein verwendet wird. HRP-konjugierte Sekundärantikörper können entweder zum kolorimetrischen Nachweis verwendet werden, bei dem das HRP die Umwandlung eines chromogenen Substrats in einen farbigen Niederschlag katalysiert, oder zum chemilumineszierenden Nachweis, bei dem das HRP ein Signal erzeugt, indem ein chemilumineszierendes Substrat zu einer Form oxidiert wird, die Licht emittiert.

Mehrere HRP-Moleküle können an einen einzelnen Sekundärantikörper binden, so dass HRP-konjugierte Sekundärantikörper zur Signalverstärkung verwendet werden können und den Nachweis von Proteinen ermöglichen, die in geringen Mengen exprimiert werden. HRP hat auch eine hohe Fluktuationsrate, die es HRP-konjugierten Sekundärantikörpern ermöglicht, in kurzer Zeit (oft innerhalb von fünf Minuten) ein starkes Signal zu erzeugen.

Alkalische Phosphatase

Mit Alkalische Phosphatase (AP) konjugierte Sekundärantikörper werden üblicherweise für ELISA und Western Blot verwendet. Sie werden manchmal auch für die Immunhistochemie verwendet, jedoch kann ihre Größe das Eindringen in Gewebe begrenzen. Es ist erwähnenswert, dass während HRP schnell, oft innerhalb von fünf Minuten, ein maximales Signal erzeugt, das Signal von AP allmählich ansteigt und nach etwa einer Stunde einen Spitzenwert erreicht. AP erzeugt ein sehr stabiles Signal, das mehrere Tage dauern kann. Dies ist besonders nützlich, wenn Mehrfachbelichtungen erforderlich sind, insbesondere über einige Tage.

Versuchen Sie, sich für Ihren Blot zwischen HRP und AP zu entscheiden?

Verwenden Sie unsere Tabelle unten, um bei der Entscheidung zu helfen.

Biotin

Biotin ist ein kleines, wasserlösliches B-Vitamin, das mit hoher Affinität durch Avidin, NeutrAvidin und Streptavidin gebunden werden kann. Aufgrund seiner geringen Größe beeinflusst die Bindung an Biotin normalerweise nicht die biologische Aktivität eines Proteins. Mehrere Biotinmoleküle können an einen einzelnen Sekundärantikörper konjugieren, so dass Biotin-konjugierte Sekundärantikörper zur Signalverstärkung verwendet werden können und den Nachweis von Proteinen ermöglichen, die in geringen Mengen exprimiert werden. Die Visualisierung erfolgt durch Biotin / Streptavidin-Wechselwirkung, wobei das Streptavidin entweder an HRP oder eine fluoreszierende Sonde gebunden ist. Durch Verwendung eines Biotin-konjugierten Sekundärantikörpers kann der gleiche Sekundärantikörper in mehreren Anwendungen verwendet werden, indem einfach das verwendete Streptavidin ausgetauscht wird.

Fluoreszenzfarbstoff-konjugierte Sekundärantikörper ermöglichen ein helleres Signal und bieten die Möglichkeit, zwischen mehreren Proteinen in einer einzelnen Probe zu unterscheiden. Als solche sind sie ein wertvolles Werkzeug zur Identifizierung von Proteinen in den Bereichen Immunzytochemie, Western Blot, Immunfluoreszenz, Immunhistochemie und vielen weiteren Anwendungen . Übliche Fluoreszenzfarbstoffe umfassen die Alexa Fluor-Reihe, AMCA, Cy3, FITC, PE und TRITC.

Beispiele für die Fluoreszenzdetektion:

Ein Antikörper ist ein "Y-förmiges" Glykoprotein, das an spezifische Antigene binden kann. Jeder Antikörper besteht aus vier Polypeptidketten, zwei identischen schweren Ketten und zwei identischen leichten Ketten, die in Sequenz und Länge zwischen Spezies und zwischen Isotypklassen variieren. Die Struktur eines Antikörpers kann unterteilt werden in: zwei F(ab)-Regionen, die oberen Abschnitte des "Y", die die variable Region enthalten, die spezifisch an ein bestimmtes Epitop auf dem Antigen bindet; einen Scharnierbereich; und eine Fc-Region am unteren Ende des "Y", die eine Bindungsstelle für endogene Fc-Rezeptoren (und sekundäre Antikörper) bereitstellt.

Bei Säugetieren werden Antikörper entsprechend der in ihnen enthaltenen schweren Kette in fünf Hauptklassen oder Isotypen eingeteilt. Dies sind: IgA (alpha), IgD (delta), IgE (epsilon), IgG (gamma) und IgM (mu). Jede Klasse unterscheidet sich in der Reihenfolge der konstanten Domänen, der Anzahl der konstanten Domänen, der Scharnierstruktur und der Wertigkeit des Antikörpers. Die leichten Ketten eines Antikörpers werden basierend auf ihrer Polypeptidsequenz entweder als Kappa oder Lambda klassifiziert. Typischerweise sind die beiden leichten Ketten in einem einzelnen Antikörper vom gleichen Typ.

Ganze Antikörper können durch Papain oder Pepsin verdaut werden, um F(ab), F(ab’) und F(ab’)₂-Fragment-Antikörper zu bilden, die keinen Fc-Anteil oder einen signifikant reduzierten Fc-Anteil aufweisen. Die Strukturen der F(ab), F(ab') und F(ab')₂-Fragmente unterscheiden sich: F(ab)-Fragmente sind einzelne antigenbindende F(ab)-Teile, F(ab')-Fragmente sind einzelne F(ab)-Abschnitte mit vorhandener Scharnierregion, und F(ab')₂-Fragmente sind zwei F(ab)-Abschnitte, die über die Scharnierregion verbunden sind. F(ab), F(ab') und F(ab')₂-Fragment-Sekundärantikörper werden verwendet, um die unspezifische Bindung zwischen der Fc-Region eines Antikörpers und dem Fc-Rezeptor auf einer Zelle zu verhindern.

Antikörperklassen und Unterklassen

Die Spezies des Sekundärantikörpers hängt von der Wirtsspezies des Primärantikörpers ab, den Sie verwenden. Sekundäre Antikörper werden gegen eine Immunglobulinklasse oder -unterklasse einer bestimmten Spezies entwickelt. Sie müssen einen Sekundärantikörper auswählen, der in einer anderen Spezies gegen die Wirtsspezies und den Isotyp des Primärantikörpers gezüchtet wurde. Wenn Sie beispielsweise einen polyklonalen Primärantikörper aus Ziege verwendet haben, benötigen Sie einen Sekundärantikörper gegen Ziege IgG (Heavy & Light Chains), der in einer anderen Spezies hergestellt wurde.

Affinitätsgereinigte Sekundärantikörper werden einem Prozess unterzogen, um nicht klassenspezifische Sekundärantikörper zu entfernen; Infolgedessen erzeugen diese sekundären Antikörper weniger Hintergrundsignale und sind eine beliebte Wahl unter Forschern. Zum Beispiel würde ein sekundärer Kaninchen-Anti-Maus-IgG2a-Antikörper unter Verwendung von immobilisiertem Maus-IgG2a affinitätsgereinigt, um alle Kaninchen-Antikörper zu reinigen, die an Maus-IgG2a binden. Diese Anti-IgG2a-Antikörper können dann weiter gereinigt werden, indem sie durch Chromatographiesäulen geleitet werden, die Maus-IgE, IgG1, IgG2b, IgG3 und IgG4 (usw.) enthalten; Dadurch werden alle Antikörper entfernt, die mit anderen Isotypen als IgG2a kreuzreagieren.

F(ab), F(ab’) und F(ab’)₂-Fragment-Antikörper werden verwendet, um die unspezifische Bindung zwischen der Fc-Region eines Antikörpers und dem Fc-Rezeptor auf einer Zelle zu eliminieren. Diese Fragmentantikörper binden immer noch an Antigene, haben aber entweder keinen Fc-Anteil oder einen deutlich reduzierten Fc-Anteil (infolge der Verdauung durch Papain oder Pepsin). Die Struktur der F(ab), F(ab') und F(ab')₂-Fragmente unterscheidet sich: F(ab)-Fragmente sind einzelne antigenbindende F(ab)-Teile, F(ab')-Fragmente sind einzelne F(ab)-Abschnitte mit vorhandener Scharnierregion, und F(ab')₂-Fragmente sind zwei F(ab)-Abschnitte, die über die Scharnierregion verbunden sind. Es ist eine gute Idee, einen F(ab), F(ab’) oder F(ab’)₂-Fragment-Antikörper zu verwenden, wenn Sie mit Proben arbeiten, die hohe Konzentrationen an Fc-Rezeptoren exprimieren.

Die Präadsorption wird verwendet, um die Spezifität eines sekundären Antikörpers zu erhöhen, um jegliche unspezifische Bindung zu minimieren. Wenn Sie eine gleichzeitige Färbung mit mehreren Primärantikörpern und mehreren Sekundärantikörpern planen, sollten Sie die Verwendung von vorresorbierten Sekundärantikörpern in Betracht ziehen. Die Voradsorption reduziert die Kreuzreaktivität zwischen dem sekundären Antikörper und in der Probe vorhandenen endogenen Immunglobulinen.

Um präadsorbierte Sekundärantikörper zu erzeugen, werden Sekundärantikörper durch eine Matrix geleitet, die immobilisierte Serumproteine einer Reihe von Spezies enthält; Jeder Antikörper, der kreuzreagiert, wird von der Matrix aufgefangen und aus der Probe entfernt. Dadurch enthalten die vorabsorbierten Sekundärantikörper nur Antikörper, die den gewünschten Primärantikörper spezifisch erkennen.

Ein primärer Antikörper bindet mit hoher Spezifität und Affinität direkt an spezifische Antigene, um die Antigene zu reinigen oder nachzuweisen und zu messen. Primäre Antikörper können entweder als monoklonale Antikörper entwickelt werden, die an ein spezifisches Epitop des Antigens binden, oder es können polyklonale Antikörper sein, die an mehrere verschiedene Epitope des Antigens binden. Primärantikörper können entweder unkonjugiert oder direkt konjugiert mit einem Enzym (wie HRP oder AP) oder einem Fluorophor (wie Cy3 oder FITC) geliefert werden, um eine Visualisierung zu ermöglichen. Sekundärantikörper werden entwickelt, um spezifische Isotypen von Primärantikörpern zu binden. Wenn ein primärer Antikörper nicht konjugiert ist, kann er ohne die Zugabe eines konjugierten sekundären Antikörpers, der an den primären Antikörper bindet, nicht sichtbar gemacht werden. Der sekundäre Antikörper wird entweder an ein Enzym oder einen Fluorophor konjugiert, um eine Visualisierung zu ermöglichen.

Bei einer Nur-Sekundär-Kontrolle werden die Proben mit PBS oder Antikörper-Verdünnungsmittel anstelle des primären Antikörpers inkubiert. Es ist wichtig, dass der Rest des Protokolls mit den anderen Proben identisch ist. Diese Kontrolle hilft, die Spezifität der beobachteten Färbung/des beobachteten Signals zu bestimmen. Keine Färbung in der Nur-Sekundär-Kontrolle impliziert, dass die beobachtete Färbung in den anderen Proben spezifisch ist und durch die Bindung des Sekundärantikörpers an nur den Primärantikörper erzeugt wird. Eine beträchtliche Färbung in der Nur-Sekundär-Kontrolle impliziert, dass die Färbung (für alle Proben) unspezifisch ist und von der sekundären Antikörperbindung an im Gewebe vorhandene endogene Immunglobuline oder an einige andere Nicht-Zielantigene herrührt.

Sekundärantikörper ermöglichen eine Signalverstärkung, die die Sensitivität eines Assays verbessern und den Nachweis von Proteinen ermöglichen kann, die in geringen Mengen exprimiert werden. Die Signalamplifikation kann entweder das direkte Ergebnis der Bindung mehrerer sekundärer Antikörper an einen einzelnen primären Antikörper oder das Ergebnis der Verwendung eines enzymkonjugierten sekundären Antikörpers sein (d. h. je länger eine Reaktion andauern kann, desto größer ist das Signal).

Bei einer hohen Konzentration können einige Antikörper Aggregate bilden, die in Immunfärbungsassays zu einem gesprenkelten Signal führen können. Durch Zentrifugieren des Antikörperfläschchens bei hoher Geschwindigkeit für 10-15 Minuten und vorsichtiges Pipettieren der Antikörperlösung (es ist wichtig, den Boden des Fläschchens nicht zu berühren) können eventuell gebildete Aggregate entfernt werden. Es lohnt sich auch, die Sauberkeit der Objektträger und Deckgläser noch einmal zu überprüfen, da dies auch den Anschein von Sprenkeln erwecken kann. Wenn sie unter dem Mikroskop schmutzig aussehen, reinigen Sie sie mit 100 % Alkohol.

Wenn Sie ein Multi-Label-Experiment durchführen, sollten Sie darauf abzielen, nur sekundäre Antikörper derselben Spezies zu verwenden. Dadurch wird sichergestellt, dass die Sekundärantikörper nur den beabsichtigten Primärantikörper erkennen und keine anderen Sekundärantikörper.

Die Art des Etiketts, das Sie wählen, hängt von der Technik ab, die Sie ausführen. Enzymkonjugierte Sekundärantikörper (wie HRP oder AP) werden beispielsweise häufig für ELISA und Immunblotting verwendet. HRP ist sowohl ein wirtschaftliches als auch stabiles Enzym, jedoch kann AP in bestimmten Situationen (z. B. für kolorimetrische Analysen) empfindlicher sein.

Für Durchflusszytometrie, Immunhistochemie und Immunfluoreszenz können die idealen Marker entweder Enzyme oder Fluorochrome sein. Die DAB-Färbung ist als einzelne Markierung oder als zweite Farbe für die Markierung mehrerer Antigene in IHC wirksam. Alternativ kann ein zweistufiges Biotin/Avidin-System zur Signalverstärkung verwendet werden und den Nachweis von Proteinen ermöglichen, die in geringen Mengen exprimiert werden.

Die Struktur Ihres Primär- und Sekundärantikörpers kann je nach Wirt, Klonalität und Isotyp der von Ihnen ausgewählten Antikörper gleich sein oder nicht.

Ein Antikörper ist ein „Y-förmiges“ Glykoprotein, das an spezifische Antigene binden kann. Jeder Antikörper besteht aus vier Polypeptidketten, zwei identischen schweren Ketten und zwei identischen leichten Ketten, die in Sequenz und Länge zwischen Spezies und zwischen Isotypklassen variieren. Die Struktur eines Antikörpers kann unterteilt werden in: zwei F(ab)-Regionen, die oberen Abschnitte des Y, die die variable Region enthalten, die spezifisch an ein bestimmtes Epitop auf dem Antigen bindet; einen Scharnierbereich; und eine Fc-Region am unteren Ende des Y, die eine Bindungsstelle für endogene Fc-Rezeptoren (und sekundäre Antikörper) bereitstellt.

Bei Säugetieren werden Antikörper entsprechend der in ihnen enthaltenen schweren Kette in fünf Hauptklassen oder Isotypen eingeteilt. Dies sind: IgA (alpha), IgD (delta), IgE (epsilon), IgG (gamma) und IgM (mu). Jede Klasse unterscheidet sich in der Reihenfolge der konstanten Domänen, der Anzahl der konstanten Domänen, der Scharnierstruktur und der Wertigkeit des Antikörpers.

Die leichten Ketten eines Antikörpers werden basierend auf ihrer Polypeptidsequenz entweder als Kappa oder Lambda klassifiziert. Typischerweise sind die beiden leichten Ketten in einem einzelnen Antikörper vom gleichen Typ. Daher hängen die strukturellen Unterschiede zwischen primären und sekundären Antikörpern von der Spezies, dem Isotyp, der Klonalität und der Zielspezifität der beiden Antikörper ab.